Linbio 无内毒素质粒 DNA 小提中量试剂盒

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产品信息

产品组成

储存条件

室温（15-30℃）干燥条件下，可保存18个月。若溶液产生沉淀，可在37℃温浴加热至沉淀完全溶解，不影响效果。

RNase A，-20℃保存，3-6个月内可2-8℃保存。

注意事项（请在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）

1. 使用前将试剂盒中的RNase A全部加入到Buffer S1中，混匀，置于2~8℃储存。
2. 使用前请先在Buffer W2中加入无水乙醇，加入体积请参照试剂瓶上的标识。
3. 使用前，ET-free water (70% Ethanol) 中加入指定体积的无水乙醇。使用前置于-20℃预冷。
4. 使用前，检查Buffer S2是否出现沉淀，如出现沉淀应于37℃水浴中加热溶解后再使用。
5. Buffer ETR 使用前置于4℃预冷。

6. Eluent A在 65℃预热后使用，能提高质粒得率。

7. 准备42℃水浴。

操作步骤

1. 取 5-15ml 在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12,000×g离心 1 min，弃尽上清。
2. 加 500 μl Buffer S1 （请先检查是否已加入RNase A）悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
3. 加 500 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转 6-8次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min。

注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 的污染。此步骤不宜超过 5 min，以免质粒受到破坏。Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中CO2中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。

4.  加500 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合 6-8 次，12,000×g 离心 5-10 min。

注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 的污染。

5.  将上一步骤的上清液转移至一新的离心管中，加入0.3倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到DNA纯化柱

注意：1）可选步骤：若有少量白色杂质，12,000×g 离心 1-3 min，弃沉淀。

      2）DNA纯化柱的最大容积为700 µl，所以需要分次过柱。

6. 吸取步骤 5 中的混合液转移到纯化柱（置于 2 ml 离心管）中，12,000×g离心 1 min，弃滤液。将纯化柱置回2ml离心管，加 500 μl 蛋白洗涤液Buffer W1，12,000×g 离心 1 min，弃滤液。

7. 将纯化柱置回2ml离心管，加 500 μl 蛋白洗涤液Buffer W1，12,000×g 离心 1 min，弃滤液。

8. 将纯化柱置回2ml离心管，加 700 μl 漂洗液Buffer W2（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000×g 离心 1 min，弃滤液。

9. 重复操作步骤7。

注意：两次使用Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

10. 将纯化柱置回 2 ml 离心管中，12,000×g 离心 1 min。

11. 将吸附柱移入新的 1.5 ml 离心管中，在吸附柱膜中央加 150 μl Eluent A ，室温静置1 min。12,000×g 离心 1 min。

12. 弃吸附柱。在滤液中加入150 µl 预冷的Buffer ETR，剧烈混合1 min。

注意：如果Buffer ETR浑浊，于冰上静置，直至溶液变得清亮；如果出现分层，则需混合均匀后使用。

13. 加入38 µl Buffer PF，混合均匀后于42 °C 孵育 2 min。12,000×g 离心 2 min。

注意：孵育后溶液为浑浊。

14. 取上相（透明）至1.5 ml离心管中，加入0.8倍体积异丙醇（如：取得350 µl 无色上相，则加入280 µl 异丙醇），混合均匀。室温静置10 min。12,000×g离心10 min。

15. 弃尽上清。加入1 ml 预冷的 ET-free water （请先检查是否已加入无水乙醇），12,000×g 离心 5 min。

16. 尽可能弃尽上清。在超净台中干燥5-10 min。

注意：管壁上残留液体可短暂离心后吸弃。

17. 加入30~50 µl Eluent A溶解质粒DNA。