Linbio 无内毒素质粒 DNA 大量试剂盒

说明书下载：PDF

产品信息

产品组成

储存条件

室温（15-30℃）干燥条件下，可保存18个月。若溶液产生沉淀，可在37℃温浴加热至沉淀完全溶解，不影响效果。

RNase A，-20℃保存，3-6个月内可2-8℃保存。

注意事项（请在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）

1. 使用前将试剂盒中的RNase A全部加入到Buffer S1中，混匀，置于2~8℃储存。
2. 使用前请先在Buffer W2中加入无水乙醇，加入体积请参照试剂瓶上的标识。
3. 使用前，ET-free water (70% Ethanol) 中加入指定体积的无水乙醇。使用前置于-20℃预冷。
4. 使用前，检查Buffer S2是否出现沉淀，如出现沉淀应于37℃水浴中加热溶解后再使用。
5. Buffer ETR 使用前置于4℃预冷。
6. Eluent A在 65℃预热后使用，能提高质粒得率。
7. 准备56℃水浴。

操作步骤

1. 取80-200 ml在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12,000×g离心 2-3 min，弃尽上清。
2. 加10ml Buffer S1 （请先检查是否已加入RNase A）悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
3. 加10ml Buffer S2，温和并充分地上下翻转 6-8次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min。

注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 的污染。此步骤不宜超过 5 min，以免质粒受到破坏。Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中CO2中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。

4.  加10ml Buffer S3K，温和并充分地上下翻转混合 6-8 次，12,000×g 离心 5-10 min。

注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 的污染。

5.  将步骤4中的上清转入新的50ml离心管(自备)中，向上清中加入10 ml 4℃预冷的 Buffer B，温和并充分地上下翻转混合10次。
6. 先将大量制备管放入50mI离心管中。吸取步骤5中的混合液,转移到大量制备管中。12000×g 离心2min。
7. 弃滤液，加12 ml BufferW1至制备管中，12000×g离心2 min。
8. 弃滤液，加 14 ml BufferW2至制备管中，12000×g离心2 min。
9. 重复步骤8。
10. 将制备管置于另一洁净50ml离心管中,在制备管膜中央加2ml Eluent A，室温静置5min，12000×g离心2 min，收集质粒DNA。
11. 弃制备管。在滤液中加入4ml 预冷的Buffer ETR，混合均匀。

注意：如果Buffer ETR浑浊，于冰上静置，直至溶液变得清亮；如果出现分层，则需混合均匀后使用。

12.  加入1ml Buffer PF，混合均匀。

注意：溶液可能会出现微弱的浑浊现象，此为正常现象。

13. 置于56℃孵育8 min。室温 4000×g离心5 min。

注意：孵育后溶液将出现大量乳白色沉淀，否则延长孵育时间。

孵育后溶液有可能出现分层现象，此为正常现象。

此步骤的离心使用水平离心机。

14. 取无色上相至50ml 离心管中，加入0.8倍体积异丙醇(如:取得6 ml无色上相，则加入4.8mI异丙醇)，混合均匀。室温静置10 min。12000×g离心10 min。

15. 弃尽上清。加入2 ml 预冷的 ET-free water(70% Ethanol)，洗涤沉淀，12000×g离心5 min。

16. 尽可能弃尽上清。在超净台中干燥5-10 min。

注意：管壁上残留液体可短暂离心后吸弃。

17. 加入 500 μl Eluent A或无内毒素水溶解质粒 DNA。