Linbio 无内毒素质粒DNA中量试剂盒

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产品信息

产品组成

储存条件

室温（15-30℃）干燥条件下，可保存18个月。若溶液产生沉淀，可在37℃温浴加热至沉淀完全溶解，不影响效果。

RNase A，-20℃保存，3-6个月内可2-8℃保存。

实验准备

1. 使用前将试剂盒中的RNase A全部加入到Buffer S1中，混匀，置于2~8℃储存。
2. 使用前请先在Buffer W2中加入无水乙醇，加入体积请参照试剂瓶上的标识。
3. 使用前，ET-free water(70%Ethanol)中加入指定体积的无水乙醇。使用前置于-20C预冷。
4. 使用前，检查Buffer S2是否出现沉淀，如出现沉淀应于37℃水浴中加热溶解后再使用。
5. Buffer ETR 使用前置于4C预冷。

       6. Eluent A在 65℃预热后使用，能提高质粒得率。

       7. 准备56℃水浴。

操作步骤

1. 取 30-50ml 在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12,000×g离心 1 min，弃尽上清。

  说明：一般过夜培养的菌液 OD₆₀₀在2.0-4.0之间。若菌液 OD₆₀₀>4，菌量需减少。

2. 加4.5ml Buffer S1 （请先检查是否已加入RNase A）悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
3. 加4.5ml Buffer S2，温和并充分地上下翻转 6-8次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min。

注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 的污染。

此步骤不宜超过 5 min，以免质粒受到破坏。

Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中CO2中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。

4.  加4.5ml Buffer S3K，温和并充分地上下翻转混合 6-8 次，直至溶液颜色均一并形成紧实的凝集块，室温放置5min。 4℃，12,000×g 离心 5-10 min。

注意：加入Buffer S3K之后应立即混合，以免形成局部凝结块。

避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 的污染。

5.  将上一步骤的上清液转移至一新的离心管中，加入4.5ml Buffer B，上下颠倒10次混匀.
6.  吸取步骤 5 中的混合液转移到制备管中， 12,000×g 离心 1 min，弃滤液。

7. 加7ml Buffer W1至制备管中，12,000×g 离心 1 min，弃滤液。

8. 加8ml Buffer W2至制备管中，12,000×g 离心 1 min，弃滤液。

   注意：确认在Buffer W2中已加入无水乙醇。

9. 重复步骤8。

说明：两次使用Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

10. 将制备管置于另一洁净1.5ml离心管中,在制备管膜中央加350μl Eluent A，室温静置1min，12000×g离心1 min，收集质粒DNA。

  说明：Eluent A在 65℃预热后使用，能提高质粒得率。

11. 弃制备管。在滤液中加入350μl 预冷的Buffer ETR，混合均匀。

注意：如果Buffer ETR浑浊，于冰上静置，直至溶液变得清亮；

如果出现分层，则需混合均匀后使用。

7.  加入88μl Buffer PF，混合均匀。

注意：溶液可能会出现微弱的浑浊现象，此为正常现象。

13. 置于56℃孵育2-5 min。室温 12000×g离心2 min。

注意：孵育后溶液将出现大量乳白色沉淀，否则延长孵育时间。

孵育后溶液有可能出现分层现象，此为正常现象。

14. 取无色上相至1.5ml 离心管中，加入0.8倍体积异丙醇(如:取得650μl无色上相，则加入520μl异丙醇)，混合均匀。室温静置10 min。12000×g离心10 min。

15. 弃尽上清。加入1 ml 预冷的 ET-free water(70% Ethanol)，洗涤沉淀，12000×g离心5 min。

16. 尽可能弃尽上清。在超净台中干燥5-10 min。

注意：管壁上残留液体可短暂离心后吸弃。

17. 加入 150-300 μl Eluent A或无内毒素水溶解质粒 DNA。