Linbio 2 × Universal SYBR Green qPCR Master Mix （2× SYBR Green qPCR预混液）

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产品组分

*包含HotMaster Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg²⁺、SYBR Green I和Specific stabilizer。

注意事项

1. 产品中含有荧光染料SYBR Green I，强光时易分解，因此请注意避光保存，配制反应液时避免强光直射。
2. 2 × SYBR Green qPCR Mix解冻后有些许白色沉淀是正常现象，请室温下放置片刻并上下颠倒，沉淀溶解后使用。

实验流程

1. 反应体系（推荐冰上配置）

注：实际反应体系中各成分添加量可根据以下原则自行调整，使用前请务必混匀。

1. 若模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
2. cDNA 原液建议 5~10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 C_T 值在 20 ~30个循环为好。
3. 引物终浓度通常为 0.2 μM，也可以根据情况在 0.1~1.0 μM 之间进行调整。
4. ROX Reference Dye添加与否、添加量请根据荧光定量仪技术指导决定。

1. 反应程序

注：一般情况下，二步法扩增特异性更高，三步法扩增效率更高，可根据实际实验需求进行选择。

1. 该预变性条件适合绝大多数扩增反应，如模板结构复杂，可将预变性时间延长至5 min以提高预变性效果。
2. 退火延伸温度和时间可根据引物和目的基因长度自行调整。

*：荧光信号采集

常见问题及解决方案

• 重复性差

1. 加样体积失准：使用性能较好的移液枪；扩大反应体积，将模板进行高倍稀释后以更大体积加入反应体系。
2. 定量PCR温控失准：定期校准仪器。
3. qPCR预混液未混匀：使用前请将预混液充分混匀。

• 熔解曲线为非单一峰

1. 非特异性扩增：重新设计引物；优化扩增条件，摸索最佳引物退火温度。
2. 引物浓度过高：适当降低引物浓度。
3. 模板有基因组污染：重新制备模板。

• C_T值较大

1. PCR产物过长：推荐PCR产物长度为80~150 bp。
2. 模板降解：重新制备模板，重复实验。
3. 模板浓度过低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起或设置梯度浓度摸索。
4. 扩增效率过低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或重新设置引物。

• 内参基因的C_T值正常，但目的基因的C_T出现较晚

1. 目的基因表达量低：重新富集RNA。
2. 目的基因引物扩增效率低：稀释模板；降低退火温度；重新设计引物。

• 反应结束无扩增曲线

1. 反应循环数不够：一般设置循环数为40，但循环数过高会导致背景信号增加，降低数据可信度。
2. 引物降解：通过PAGE电泳检测引物的完整性。
3. 模板浓度过低：降低模板稀释度后重复实验，或设置浓度梯度进行实验寻找适宜浓度。

• 扩增曲线异常

1. 扩增曲线不光滑：扩增效率差（过高或过低），针对模板浓度、模板纯度、退火温度等因素进行调整优化实验体系。
2. 扩增曲线断裂或下滑：基线设置不当，基线的终点值大于C_T值，减小基线终点（C_T-4）后对数据进行重新分析。

个别扩增曲线骤降：反应管内有气泡存在，温度升高后气泡破裂，导致仪器检测到的荧光值突然降低。