蛋白表达纯化过程梳理

蛋白表达纯化过程梳理

蛋白表达目前主要有哺乳动物表达、细菌表达、酵母表达和昆虫表达。流程大方向相同，在将目标质粒导入表达系统的过程略有差异。主要过程有：

哺乳动物表达：

细菌表达

酵母表达

昆虫表达

以哺乳动物表达系统为例，来看看更详细的具体步骤。

1、克隆和转化

更为详细的步骤可参考麟得科技Linbio one-step express cloning kit，cat:#LN101101

2、质粒纯化

质粒纯化过程比较简单，可根据需求选择质粒纯化提取试剂盒来完成。麟得科技有质粒纯化#LN100901和无内毒素质粒小量提取试剂盒#LN100501可供选择。如果需要快速，大量，重复多次的提纯质粒（>200mg/单次），推荐使用层析制备方法来获得高纯度（>90%/单次）质粒。该方法对超螺旋质粒的提取效率尤为高效。麟得科技提供质粒亲和填料BiogCap plasmid HP，去杂阴离子 BiogCap Q，欢迎联系咨询。

3、转染

转染是指将核酸（例如第2步提取的质粒DNA或者是另外准备的RNA）导入细胞的过程。将外源核酸导入细胞后会发生细胞生物学的改变，从而在细胞水平上研究基因功能或者表达蛋白。经过转染后，导入的核酸有可能暂时存在于细胞内，只在有限的时间内表达而不整合到宿主染色体中，这种一般称为瞬时转染；也可能稳定存在并进行自我复制或者整合到受体细胞的基因组中，并传递至转染细胞的子代，称为稳定转染。

转染的方法有化学方法和物理方法和病毒递送的方法。化学方法主要包括阳离子脂质体转染和阳离子聚合物转染，阳离子脂质体和阳离子复合物自身带正电荷，和带负电荷的核酸通过静电作用结合形成复合物，脂质体复合物在脂质体的帮助下和细胞膜结合，并通过内吞作用进入细胞；阳离子复合物与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，也是通过内吞作用进入细胞。物理方法主要是指电穿孔法，是利用电脉冲在细胞膜上形成临时微孔，使核酸等物质通过这些微孔进入细胞的一种方法。电穿孔法优点是操作简单且快速，可在短时间内转染大量细胞。缺点是需要实验室配备电转仪，在细胞穿孔的过程中会造成大量细胞死亡，需要对脉冲和电场强度进行优化，比较适合需要大规模重复转染某些类别细胞的实验室。病毒递送的方法又叫转导，这种方法可以在难以转染的细胞类型中实现蛋白的表达或者敲低。腺病毒载体、慢病毒载体已经广泛地应用于核酸的递送。这种方法的缺点有免疫原性和细胞毒性，病毒载体生产过程耗时耗力。典型的转导方法包括携带转基因的病毒生成，用化学转染方法包装细胞系扩增生产病毒、纯化含转基因的病毒载体、利用纯化的病毒感染目标细胞、然后检测实现蛋白的过表达和敲低的作用。

麟得科技的阳离子聚合物转染试剂可以很好的用于质粒转染、SiRNA转染、病毒包装等实验，LinBioFectmine Transfection Reagent, cat.#LC300201

4、蛋白纯化

蛋白纯化步骤包括前处理、粗提和精细纯化三个步骤。前处理是指将蛋白质从组织或者细胞中释放出来，采取的手段有物理研磨、超声、渗透压还有蛋白酶K裂解等。组织和细胞破碎之后，选择合适的试剂溶解蛋白，把细胞碎片等不溶物通过离心或者过滤的方法除去。

提取纯化可以根据蛋白质溶解度不同采用盐析、等电点沉淀和低温有机溶剂沉淀法的方法；可以根据蛋白质分子大小进行分离纯化如超滤法、凝胶过滤法；可以根据蛋白质带电性质进行分离，常用的有离子交换层析法；可以根据配体特异性进行分离纯化，如亲和层析法；还可以采用琼脂糖磁珠法，该方法在琼脂糖基质的层析介质基础上，加入具有超顺磁性的纳米磁核，采用磁吸分离的方式进行纯化操作。为了得到更好的纯化效果，多会采取组合的纯化方法。下面介绍常用的几种分离纯化方法的定义。

亲和层析(Affinity Chromatography)是利用生物分子间特异性相互作用而进行分离的一种层析技术。生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等 等，它们之间都能够专一而可逆地结合，这种结合力就 称为亲和力。将具有亲和力的两个分子中一个固定在 不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性， 对另一个分子进行分离纯化的过程即为亲和层析。

凝胶过滤层析技术是根据被分离物的分子大小进行分离，这种技术在酶、蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分离纯化中起重要的作用，在各种柱层析的分离中是最温和的处理方法。凝胶过滤分离根据被分离物的分子大小进行分离，因此又称为体积排阻色谱或分子筛层析等。

离子交换层析（ion exchange chromatogra-phy，IEC）是根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。离子交换层析法具有分辨率高、易放大等优点，现已成为在生物大分子提纯中应用最广泛的方法之一。

复合模式层析介质可以同时提供两种或两种以上的作用进行分离纯化，例如同时提供凝胶过滤、离子交换、疏水作用或者同时提供离子交换、疏水作用。复合模式层析介质可以为用户提供更多的选择和更多样的纯化方式，能够实现一步纯化或者高纯度精纯。

疏水层析介质层析，此类介质由不同种类的疏水配基和高刚性琼脂糖基质组成。蛋白质在较高盐浓度环境下，会暴露出分子表面的疏水残基，且不同蛋白分子疏水作用不尽相同。利用该特性，可在高盐环境下使目标分离组分与固定相的疏水基团吸附，再使用由高到低的离子强度洗脱液分别洗脱出疏水作用不同的组分。

琼脂糖磁珠是在琼脂糖基质的层析介质基础上，加入具有超顺磁性的纳米磁核，可以采用磁吸分离的方式进行纯化操作。

麟得科技如下亲和纯化产品提供试用剂及技术支持，欢迎咨询。

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5、蛋白分析

蛋白质分析有蛋白质含量分析、纯度分析、分子量测定、氨基酸组成分析和蛋白结构分析。根据目的不同可以采用不同的分析方法，基本常规的分析方法是：BCA法（cat.#LP200401）和Bradford方法（cat.#LP200501）测定蛋白质浓度，SDS-PAGE凝胶（cat.#LP200601,#LP200101）分析蛋白质的分子量和纯度。氨基酸组成分析和蛋白结构分析本篇不涉及。后续有空再更新。