WB实验指南
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免疫印迹试验（Western blot）是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。该技术借助抗体与目的蛋白的结合作用，测量生物样品中的蛋白质水平，广泛用于检测细胞或组织提取物中蛋白表达水平。
Western blot 常见问题以及优化方案
背景较高：
l 膜的问题：一般硝酸纤维素膜比PVDF膜背景更低；在室温下，用脱脂奶粉封闭1小时。
l 一抗孵育或稀释：使用推荐的封闭剂，如5%BSA或者5%脱脂奶粉以推荐的稀释度溶解于抗体稀释缓冲液中，在4℃下，过夜孵育一抗。对于单个抗体，可根据产品推荐的稀释浓度来稀释。
l 洗涤不充分：推荐不低于三次5分钟的洗涤，另外，低浓度Tween 20可能导致高背景，推荐0.1% Tween 20。同样适用于一抗和二抗之后的洗涤步骤。
l 二抗稀释或者封闭：一些二抗与细胞提取物中的蛋白质非特异性结合。可进行无一抗的印记分析（胶片曝光检测）。二抗孵育推荐室温下5%脱脂奶粉孵育1小时。
l 检测试剂：化学发光检测要求使用高纯度水来稀释浓缩试剂。推荐使用去离子水。此外，在检测试剂曝光前，确保膜在抗体孵育过程中不变干。
l 曝光时间：检测时曝光时间超过30s可能会导致背景过高。可适当减少曝光时间。
杂带较多：
l 样本制备过程，新鲜制备的样本会产生更少的杂带，因此结果更干净。在样本制备环节尽量使用新鲜的澄清的组织提取物，并且在提取过程中添加蛋白酶抑制剂如本公司的cocktail。
l 目的蛋白有多个修饰位点，应通过查阅文献或者生物信息学分析，获取蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
l 上样量太高，应减少上样量。
l 一抗或二抗浓度过高，应降低抗体浓度。
l 一抗特异性不高或不纯，应重新选择或制备特异性高的抗体或者进行抗体纯化。
低信号
l 样品制备过程，如果靶标蛋白的基础水平或者是蛋白质修饰程度低，可能需要化学刺激剂来诱导表达或修饰。或者选用目标蛋白更高的细胞系或组织取样。添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂可防止蛋白降解，另外，对样品进行超声处理有助于和染色质和膜结合的蛋白质提取。
l 一抗
使用推荐的封闭剂（5% BSA 或 5% 脱脂奶粉），以推荐的稀释度溶解于抗体缓冲液中，在 4°C 下，过夜孵育一抗。
l SDS-PAGE 凝胶选择
l 一般来说，推荐采用 Tris-Glycine 凝胶。但是，对于高分子量蛋白质，我们推荐采用 Tris-Acetate 凝胶和相关缓冲液。另外，蛋白质从 1 毫米凝胶转移比从 1.5 毫米凝胶转移更有效。使用更厚的凝胶，可能会导致高分子量蛋白质的转移不完全，因此推荐监测转移效率，根据目的靶标蛋白质分子量大小，优化转移条件。
l 转移和膜
l 可通过延长转移时间或使用更高的电压，改善转膜不完全。
l 封闭
l 膜封闭时间过长可能会掩盖抗原表位，并阻止抗体结合。在室温下仅封闭 1 小时。
l 洗涤
洗涤时间超过推荐的三次，5分钟是一个常见问题，可能会导致减少信号。
l 二抗稀释和/或孵育
可用相同的细胞提取物和一抗在印迹上进行二抗的梯度稀释，以优化二抗浓度。在室温下，在含 5% 脱脂奶粉的抗体缓冲液中孵育二抗 1 小时。避免在 HRP-偶联二抗的缓冲液中加入叠氮化钠，因为叠氮化物会抑制 HRP 的活性。
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